Drahý mikrob

Share Tweet Pin it

Vzhledem k tomu, doba Pasteur je dobře známo, že v lidském gastrointestinálním traktu, je v podstatě typu bioreaktoru tok, ve kterém množství mikroorganismů obývají. Postoj vědců k intestinální mikroflóře během této doby se radikálně změnil. Před sto lety, velký Ilya Mechnikov, zakladatel moderní teorie imunity, pro vytvoření kterého on přijal Nobelovu cenu (pro dvě osoby s jeho nesmiřitelného soupeře, ne méně než velký Paul Ehrlich), dokonce navrhoval odstranění tlustého střeva jako způsob, jak prodloužit život. A těch, kterým toto opatření jeví jako příliš radikální, doporučuje vypít velké množství jogurtu vytěsnit škodlivý, podle jeho názoru, mikroby prospěšné laktobacily. Za půl století se kurz změnil o 180 stupňů. Ukázalo se, že normální střevní mikroflóry, stejně jako kůže a sliznic, vykonávat mnoho užitečných funkcí - například potlačit vitální funkce organismu neustále útočí na patogeny. A v posledních letech, nejodvážnější z mikrobiologů šli ještě dále tím, že prohlásí osobě a jeho symbiotické mikrobů single superorganism.

Vývoj metod molekulární biologie vedl vědce k nové úrovni porozumění procesům symbiózy člověka a jeho mikroflóry, která se zdála být dobře studovaná a ze studie, o které neočekávali zvláštní překvapení. Rychlý nárůst rychlosti a nákladů metod DNA sekvenování (určení jeho nukleotidové sekvence) a souběžné zvyšování síly osobních počítačů a rozvoj internetu umožnilo analyzovat informace o velkých částech genomů. Po rozčlenění chromozomů stovek druhů jednotlivých bakterií se v genetice mikroorganismů objevil nový přístup: populační přístup: analýza genů všech bakterií, které obývali určitou oblast. Samozřejmě, populace "lidského bioreaktoru" se ukázala jako jedna z nejdůležitějších pro studium mikrobiálních populací.

První práce, která provedla nový pohled na intestinální mikroflóru, byla publikována v roce 1999 skupinou vědců z Národního institutu pro výzkum v oblasti zemědělství (Francie) a University of Reading (Velká Británie). Autoři se rozhodli použít metodu sekvenování genů 16S RNA pro studium populace mikrobiálního střeva.

16S RNA - identifikace bakterií

Od dob Pasteur první a nezbytný krok při stanovení mikroorganismů byl jejich pěstování na živném médiu. Ale mnoho důležitých (a užitečných a patogenních) mikrobů nechce růst na žádném médiu. Studijní dříve nedostupné nekultivovatelná bakterie a začnou vyčistit naprosto matoucí taxonomii známých prokaryot bylo možné s rozvojem bioinformatiky a příchodem moderních technik molekulární biologie - polymerázové řetězové reakce (PCR), která umožňuje z jednoho kusu DNA získat miliony a miliardy přesné kopie, klon izolován z PCR genů do bakteriálních plasmidů a nukleotidových sekvenčních metod, výsledný to vše v dostatečné pro ana Výše Iza.

Ideální marker pro identifikaci mikroorganismů ukázaly genu kódujícího 16S ribozomální RNA (každé ze dvou ribozomální podjednotky - dílny buněčnou proteosyntézu - se skládá z prokládaných řetězců molekul proteinů a ribonukleové kyseliny).

Tento gen je v genomu všech známých bakterií a archaea, ale chybí v eukaryotech a viry, a pokud se najít jeho charakteristickou sekvenci nukleotidů, - jsou si jisti, že co do činění s geny z prokaryot. (To je velmi přesný, gen 16S RNA a tam u eukaryot, ale ne v jaderných chromozomů a mitochondriální To opět potvrzuje, že mitochondrie -. Vzdálení potomci symbiotické bakterie prvních eukaryotických organismů.)

Tento gen má konzervativní místa, stejně pro všechny prokaryoty a druhy specifické. Konzervativní výkresy jsou pro první stupeň polymerázové řetězové reakce - přidání cílové DNA s primery (osiva DNA úseky, na které studoval nukleotidová řetězce by se měly připojit ke spuštění analyzovat zbytek sekvence) a druhově specifických - pro identifikaci druhu. Navíc stupeň podobnosti druhově specifických lokalit velmi dobře odráží evoluční vztah různých druhů.

Další bonus - pro klonování a následnou analýzu můžete použít samotnou ribozomální RNA, která je v každé buňce přítomna mnohem větší množství než odpovídající gen. Pouze musíme nejprve "přepsat" do DNA pomocí speciálního enzymu - reverzní transkriptázy.

Jsou obecně dostupné nukleotidové sekvence 16S RNA všech známých bakterií a archaea (asi 10 000 druhů). Identifikované sekvence se porovnávají s těmi nalezenými v databázích a přesně identifikují druh bakterie nebo prohlašují, že patří k dalším nekultivovaným druhům.

Nedávno došlo k intenzivní revizi staré fenotypové klasifikace bakterií založené na špatně formalizovaných kritériích - od výskytu kolonií po potravní preference a schopnost skvrnit různými barvivy. Nová systematika je založena na molekulárních kritériích (16S RNA) a jen částečně se opakuje fenotypová.

Kódující sekvence 16S RNA PCR byl získán přímo z „prostředí“ - 125 miligramů člověka, bohužel, stolice, byl vložen do plasmidu E. coli (ne proto, že střevní, a proto, že je Escherichia coli - jedna z molekulárních biologů oblíbený Workhorse ) a opět izolován z kultury násobených bakterií. Tak byla vytvořena knihovna 16S RNA genů pro všechny mikroorganismy ve vzorku. Poté bylo 284 klonů náhodně vybráno a sekvenováno. Ukázalo se, že pouze 24% výsledných 16S RNA sekvencí patřilo k dříve známým mikroorganismům. Tři čtvrtiny mikroflóry se nachází ve střevech každého člověka, více než sto let se vyhnout pozornosti výzkumníků, vyzbrojený metodami klasické mikrobiologie! Vědci prostě nemohl najít podmínky pro pěstování těchto bakterií, protože většina obyvatel náladový střev odmítla vystoupit na tradiční mikrobiální prostředí.

K dnešnímu dni, používající molekulární techniky zjištěno, že dospělý člověk mikroflóry prezentovány 10 z 70 hlavních bakteriálních taxonů. Asi 90% našich mikrobů patří k typu Firmicutes (sem patří například slavný laktobacily - hlavní „viníky“ okyselení mléka) a Bacteroidetes - obligátní anaerobní bakterie (organismy, které mohou žít pouze v nepřítomnosti kyslíku), které jsou často používány jako ukazatel znečištění přírodní vodní kanalizace. Zbývajících 10% populace rozděleno mezi taxonů Proteobacteria (mezi ně patří, mimo jiné, E. coli), Actinobacteria (od jednoho z druhů, aktinomycet antibiotické streptomycinu byl izolován), Fusobacteria (normální obyvatele ústní dutiny a často způsobují periodontitis), verrucomicrobia (v poslední době v geotermální pramen byl objeven ve formě mikrobů, které se živí metanem, které oplývají ve střevě kvůli jiným mikroorganismům), sinice (stále jsou často označovány jako starý název „modrozelené řasy»), Spirochaeates (pro Wait Tew, ne bledý), Synergistes a VadinBE97 (jaký druh zvířat, zeptejte se tvůrci nové taxonomii prokaryotes).

Navzdory skutečnosti, že druhové složení střevních mikroorganismů je spíše monotónní, kvantitativní poměr zástupců některých systematických skupin v mikrobiologii různých lidí se může značně lišit. Ale co je normální intestinální mikroflóra a jaké jsou její způsoby vzniku?

Tato otázka byla zodpovězena v práci skupiny amerických biologů pod vedením Patricka Browna ze Stanfordské univerzity v roce 2007. V průběhu prvního roku života vysledovaly vznik 14 mikrobiózních novorozenců. Autoři uspěli ve vytvoření několika zdrojů kolonizace gastrointestinálního traktu. Mikrobiota dětí byla podobná mikroflóře matky: vaginální, fekální nebo mikroflorní vzorky mateřského mléka. V závislosti na zdrojích kolonizace v mikroflóře střev novorozenců během prvního roku života převládaly různé druhy. Tyto rozdíly zůstávaly významné po celou dobu studia, ale ve věku jednoho roku se projevovaly rysy tvorby dospělé mikrobiologie. Zajímavé údaje byly získány za použití dvojice dvojčat. Jejich mikroflóra byla prakticky shodná ve složení a stejným způsobem se lišila. Toto zjištění odhalilo obrovskou roli lidské složky hostitelské mikrobiální dvojice při tvorbě populace střevní mikroflóry. Pro čistotu experimentu bychom samozřejmě měli oddělit děti v nemocnici - skvělý příběh indického filmu! O několik let později se navzájem znají analýzou... Ale jiné studie potvrdily předpoklad, že individuální, včetně hereditárně podmíněných rysů lidské biochemie mají velký vliv na složení své mikrobiologie.

Mikrobiální v nás víc než člověk

Kromě studia některých druhů střevní mikroflóry, v posledních letech, mnozí badatelé studují bakteriální metagenom - sadu genů všech organismů ve vzorku s obsahem lidského střeva (nebo zrudnutí kůže, nebo ve vzorku bahna z mořského dna). Pro tento účel, nejvíce automatizované, počítačové a vysoce výkonné sekvenování DNA technologie, které umožňují analýzu krátké nukleotidové sekvence, sbírat puzzle několik nesouhlasné „písmen“ na koncích těchto částí, roztroušená Opakujte tento postup pro každý kus genomu a přijímat dekódování jednotlivých genů a chromosomů rychlostí až 14 milionů nukleotidů za hodinu - řádově o něco rychleji, než tomu bylo před několika lety. Tak bylo zjištěno, že lidské střevní mikroflóry má přibližně 100 bakteriálních buněk trillionov - asi 10 krát větší, než je celkový počet master buněk v těle. Sada genů, které jsou součástí bakteriální metagenomu, přibližně 100-krát množina genů lidského těla. Pokud budeme hovořit o množství biochemických reakcí probíhajících v rámci mikrobiální populace, znovu ji mnohonásobně vyšší než u lidského těla. Bakteriální „reaktor“ se provádí v hostitelském metabolického řetězce, který, který není schopen se sám podporovat - například syntéza vitamínů a jejich prekurzory, rozklad některých toxinů, rozklad celulózy na polysacharidů (u přežvýkavců), atd.

Studie prováděné v laboratoři Jeffrey Gordon (School of Medicine na Washington University, St. Louis, MO), naváže druhovou diverzitu bakterií trávicího traktu s dietou a vlastností konkrétního metabolismu. Výsledky experimentu byly publikovány v prosincovém vydání Nature v roce 2006. Roční experiment naznačil vznik korelace mezi nadváhou v osobě a složením mikrobiální populace jeho střeva. Tucet tuků, které souhlasily s tím, že si položí břicho na oltář vědy, byly rozděleny do dvou skupin. Jedna vesnice s nízkým obsahem tuku, druhá s nízkým obsahem sacharidů. Všechny dobrovolníků zhubl, a zároveň se změnily poměr dvou hlavních skupin střevních mikroorganismů: počet buněk Firmicutes snížily, zatímco počet Bacteroidetes, naopak zvyšuje. Na tuku dietu s nízkým obsahem taková změna se stala prominentní později - poté, co pacient ztratil 6% hmotnostních a s nízkým obsahem sacharidů - poté, co prohrál první kg (2% počáteční tělesné hmotnosti). Současně byla změna složení mikroflóry ještě výraznější, tím menší byla hmotnost účastníků experimentu.

Současně ve stejné laboratorních experimentech byly provedeny na laboratorních myší nesoucích mutaci v genu pro leptin - „sytosti hormonu“ proteinu, který je syntetizován v tkáňových buněk tukových, a dá jeho příspěvek k tvorbě sytosti. Myši, které poškodily obě kopie tohoto genu (tato mutace je označena indexem Lep ob) jíst o 70% více než divoký typ se všemi následnými následky. Obsah Firmicutes ve střevech a půl krát vyšší, než je z heterozygotních linek, pouze s jedním defektní alely (ob / +) a homozygotní pro normální gen kmenů divokého typu (+ / +).

Vliv mikroflóry v metabolismu její „pán“ výzkumníků kontrolovány na jiný model - gnotobiotických myší.

Taková zvířata, od narození, kteří žijí ve sterilních komnatách a nikdy se s nimi nenacházejí žádné mikrobi, se v biomedicínském výzkumu často nepoužívají. Absolutní sterilita u myší, králíka a tím více kozí stodoly - je to drahé a neklidné a po setkání s prvním mikrobem nebo virem chudí buď zemřou, nebo se stanou nevhodnými pro další experimenty. Co se děje v gnotobioch s imunitním systémem je samostatný příběh a jedí po dobu tří a současně - kůže a kosti kvůli nedostatku mikrobiální složky trávení.

Po transplantaci mikroflóry od obézních (ob / ob) dárců byly gnotobiotické myši skoro 50% vykrmovány po dobu dvou týdnů (o 47%). Ti, kteří byli "zasiti" mikroflorou od dárců divokého typu (+ / +) s normální hmotností, se uzdravili pouze o 27%.

Výsledky dalších studií změn symbiotického myšího mikrobiálního organismu brilantně potvrdily hypotézu, že mikrobiota obézních jedinců přispívá k hlubšímu zpracování potravin. Porovnání vzorků DNA stolice obézních a normálních myší ukázalo, že myši obézních myší jsou nasyceny enzymovými geny, které umožňují účinnější rozklad polysacharidů. Čelo obézních myší obsahovalo velké množství konečných fermentačních produktů - sloučenin kyseliny octové a kyseliny máselné, což naznačovalo hlubší zpracování potravinových složek. Kalorimetrická analýza (ze slova "kalorie"!) Analýza vzorků stolice potvrdila toto: ob / ob myší židle obsahovala méně kalorií než divoké myši, které zcela neabsorbovaly energii z jídla.

Kromě důležitých informací o „zárodečné“ složky obezity, autoři byli schopni prokázat zásadní podobnost mezi mikroflóry obézních lidí a myší, což otevírá nové možnosti při studiu problému nadváhy a snad - a vyřešit tento problém tím, že „převodu“ zdravé mikroflóry nebo její tvorby u pacientů, kteří trpí obezitou.

Skutečnost, že mikrobiota může řídit metabolismus hostitele, již není pochyb. Studie Gordon laboratoř zaměřená na problém nadměrné hmotnosti bylo možné překlenout mezeru na léčbu metabolických onemocnění, jako je například kachexie, postihuje děti od jednoho roku do čtyř let v chudých tropických zemích - marazmus (na idiotství, že slovo má pouze jazykově: řecké marasmos. doslovně znamená vyčerpávání, zánik) a Kwashiorkor (v jazyce jednoho z kmenů Ghaně kwashiorkor - „Red boy“). Výskyt onemocnění spojených s nedostatkem bílkovin a vitamínů v přechodu od kojení až po dospělé potraviny. Ale onemocnění selektivně postihuje děti, jejichž bratři a sestry nemají žádné problémy s přechodem na tradiční stravu pro tento region. Studie prokázaly, že střevní mikroflóra nemocných dětí je velmi odlišný od mikroflóry svých rodičů, stejně jako mikroflóry zdravých sourozenců. Nejprve byla téměř úplná nepřítomnost ve střevní populaci Bacteroidetes a dominance vzácných druhů patřících k typům Proteobacteria a Fusobacteria. Po nemocné děti (pozor, aby se předávkování!) Vykrmováno hard-protein potraviny, jejich mikroflóry stává podobný normální, jako jsou příbuzní, s převahou Bacteroidetes a Firmicutes.

Nedávné studie nejen radikálně změnila převládající představy o lidské střevní mikroflóry, ale také přispěl ke vzniku konceptu, který považuje střevní mikroflóry jako další mnohobuněčného „orgán“ v lidském těle. Orgán sestávající z různých buněčných linií, schopných komunikovat s sebou navzájem i s hostitelským organizmem. Orgán, který přerozděluje toky energie, provádí důležité fyziologické reakce, změny pod vlivem životního prostředí a sám se zotavuje se změnami způsobenými vnějšími podmínkami.

Pokračoval výzkum „bakteriální tělo“ může a měla by vést k pochopení zákonů jeho fungování, zveřejňování jeho delikátních vztahů s hostitelem a v důsledku toho, že se objevují nové metody boje proti lidské choroby cílenou léčbu dysfunkcí obou metaorganizma složek.

Valery Poroiko, Ph.D.
Univerzita v Chicagu, Oddělení všeobecné chirurgie
Portál «Věčné mládí» www.vechnayamolodost.ru

Časopisová verze článku je publikována v publikaci "Popular Mechanics" č. 4-2008

Specifická identifikace bakterií metodou sekvenování genu 16S ribozomální RNA, role a místo metody v diagnostice bakteriálních infekcí. Dokončeno: Savelyeva. - prezentace

Prezentace byla publikována před 4 roky předLoudmylou Šoumíhinou

Související prezentace

Prezentace 11. třídy na téma: "Specifická identifikace bakterií metodou sekvenování genu 16S ribozomální RNA, role a místo metody v diagnostice bakteriálních infekcí. Ukončeno: Savelyeva". Stáhněte si zdarma a bez registrace. - Přepis:

1 druh identifikace bakterií sekvencování genu 16S ribozomální RNA, role a místo metodou v diagnostice bakteriálních infekcí splněny: Savelieva Xenia splněny: Savelieva Xenia, žák 11 specializovaná třída žák 11 specializovaná třída MBOU Krasnoobsk SOSh 1 MBOU Krasnoobsk SOSh 1 Školitel: Vedoucí : Cand. Biol. Vědy Afonyushkin Vasily Nikolaevich Cand. Biol. Vědy Afonyushkin Vasily Nikolaevich

2 Cíle: 1. zvládnout elektroforéza DNA na agarózovém gelu 2 Chcete-li získat metodu pro analýzu výsledků sekvencování, a provést výstavbu nukleotidových sekvencí, genových fragmentů 16 S ribozomální RNA izolátů získaná mistra rodu Bacillus 1. DNA elektroforézou na agarózovém gelu 2 Chcete-li získat metodu pro analýzu výsledků sekvenování a provést výstavbu nukleotidových sekvencí, genové fragmenty 16 s ribozomální RNA izolátů získaných rod Bacillus 3. provede sdílení sekvenčních technik pro biochemii a perspektivu identifikace cal bakterií 3. studovat vyhlídky na sdílení metody sekvenování, a biochemické identifikace bakterií Cíl: Pro studium možnosti způsobu specifické identifikaci bakterií sekvenováním 16S ribozomální RNA ve spojení s tradičními metodami identifikace

3 materiály a metody Čisté kultury izoláty byly naneseny na MPA hodin a po inkubaci se bakteriální suspenze byla připravena ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku. Kultury byly barveny Gramem a mikroskopicky. Hodnoceny na základě biochemických vlastností: Odstranění citrát, malonát, glukóza, laktóza, mannitol, sacharóza, inositol, sorbitol, arabinózy, maltóza, fenylalaninu, tvorba indolu, sirovodík, atsetilmetilkarabinola (reakce Foges- Proskauerův), přítomnost beta-galaktosidázy, ureázy, arginin dekarboxylázy a lysin, hydrolázy argininu. Kultury byly testovány na katalázy, oxidázy cytochromu, tvorbu dusitanů, syntézy pigmentu, rezistence k antibiotikům, a studoval kultury a morfologické vlastnosti. Beta-galaktosidázy a tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktivita byla testována na střední Uriselekt 4 (BioRad) DNA se izoluje podle zobrazeni fenolhloroformennym stanovena na základě sekvenování 16S ribozomální gen RNAi fragmentu intergenové spaceru ribozomální RNA a 16-23S množství biochemické, kulturních a morfologické charakteristiky.

4 Kulturní vlastnosti: pěstované kultury nevyrostly v prostředí Endo; netýkala enterobakterií, pěstovaných na agaru maso peptonem za aerobních podmínek při teplotě 37 ° C vybarvovací vlastnosti: kultura pěstuje zkoumány mikroskopicky a gram-barvení, která umožnila stanovit, že získaná kultura jsou spór Gy + hole Charakteristika kultury

5 Schéma zkoumání: DNA byla kultivována z rostoucích kultur a PCR byla aplikována s univerzálními primery, v důsledku toho jsme amplifikovali fragment 16S genu ribozomální RNA

6 se základním roztokem rozděleny do 4 zkumavek, z nichž každá se čtyř deoxynukleotid dATP, dCTP, dTTP (jeden radioktivnym izotopem značené), a jeden ze čtyř 2; 3- dideoxynukleotidy (ddATR, ddTTR, ddGTP, dd MFR) dideoxynukleotidového To je obsažena ve všech polohách rostoucích řetězců směsi, a po vstupu do růst řetězce je okamžitě zastavit. Výsledkem je, že v každé ze čtyř trubek za účasti DNA polymerázy generován unikátní soubor olignukleotidov různých délek obsahující praymerovuyu sekvence. Dále zkumavky byly přidány do formalid divergence řetězce a elektroforézou na gelu polyakrylových cheteryh stop. U nás autoradiografie, díky němuž je možné „číst“ sekvencování nukleové sekvenci DNA segmentem. V biochemii a molekulární biologie elektroforéze se používá k oddělení makromolekulární proteinů a nukleových kyselin (a jejich fragmentů). Existuje mnoho druhů této metody. Tato metoda najde široké uplatnění pro separaci směsí biomolekul na frakce nebo jednotlivých látek a používá se v biochemie, molekulární biologie, Clinical Diagnostics, biologie populace (pro studium genetické variability) a dr.belkovnukleinovyh kyseliny elektroforézy tento elektrokinetické jev posunutí dispergované fáze (koloidní nebo protein roztok) v kapalném nebo plynném prostředí, působením vnějšího elektrického polya.elektrokineticheskoe yavlenieelektricheskogo polyaElektroforez Schéma studie: PCR produkty byly separovány elektroforézou na agarózovém gelu. Sangerova metoda

Výsledky vlastního výzkumu Obr. 1 Výsledky kapilární elektroforézy fragmentu 16S genu ribozomální RNA

8 Obr. 2 fylogenetický strom vytvořený na základě výsledků zarovnání fragmentu 16S genu ribozomální RNA

9 Výsledky vlastního výzkumu Obr. 3 Výsledky srovnání nukleotidových sekvencí

10 Výsledky biochemické studie kultur pomocí zkoušky PBDE biochemické vlastnosti kmene B. licheniformis: negativní využití citrát, malonát negativní, citrát sodný + glukóza negativní negativní negativní lysin, arginin, ornithin, fenylalanin negativní negativní, indol negativní, ureázy pozitivní atsetilmetilkarabinol negativně sulfid negativní, pozitivní, glukóza, b-galaktosidázy pozitivní, negativní laktóza, mannitol pozitivní, pozitivní, sacharóza, inositol pozitivně o, sorbitol je pozitivní, maltóza je pozitivní

11 Závěr identifikace druhů mikroorganismů na základě sekvenování může být „zlatý standard“ pro laboratorní diagnostiky, ale přesnost metody je omezena spolehlivost a úplnost databázi GenBank a proto vyžaduje použití dalších konfirmačních testů.

Analýza 16s RNA

Biotechnologie, 2005, č. 6, od 3-11

Je navržen způsob identifikace mikroorganismů založený na analýze polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCRF) genového produktu 16S RNA s délkou 1500 nukleotidů. 6 uzavřeno sada restrikčních endonukleáz (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI a RsaI), pomocí RFLP umožňuje identifikaci širokého spektra mikroorganismů.
Byly izolovány čtyři izoláty termolabilní alkalické fosfatázy z izolátů přírodní mořské vody. Analýza PFR pro tyto kmeny ve srovnání s vypočtenými výsledky získanými pro 16S RNA geny různých mikroorganismů umožnila prokázat, že identifikovaní producenti patří do rodu Alteromonas.

Spolu s tradičními metodami identifikaci mikroorganismů pomocí kulturních a morfologické vlastnosti, jakož i chemické a biochemické reakce [1], v poslední době stále více používaných metod pro stanovení mikroorganismů jsou založeny na srovnání nukleotidových sekvencí genů z různých mikroorganismů [2-4] a délka polymorfismus analýza DNA restrikčních fragmentů získaných amplifikaci specifických bakteriálních genů [5,6]. Většina z nich jsou vhodné pro identifikaci genů kódujících 16S a 23S ribozomální RNA, protože jsou přítomny ve všech bakteriálních buňkách jsou rodově specifické a pro většinu mikroorganismů, [7-9]. Slouží k identifikaci DNA fragment obsahující jak geny 16S a 23S RNA, a distanční vložku, umístěnou mezi nimi a jsou variabilnější, umožňuje rozlišení mezi blízce příbuzných druhů a poddruhů mikroorganismů [10].

Tento dokument představuje výsledky RFLP analýzy PCR produktu 1500 nukleotidů pro různé mikroorganismy, a ukázal, že použití restrikčních endonukleáz 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI a lze spolehlivě identifikovat většinu mikroorganismů. Papír identifikovány 4 novému výrobci termolabilní alkalické fosfatázy a podle navrženého způsobu, srovnávací analýzu RFLP pro identifikaci těchto mikroorganismů. Na základě srovnání na základě dospěla k závěru, že výrobci výsledky patří do rodu Alteromonas.

EXPERIMENTÁLNÍ PODMÍNKY

Pro detekci produkující termolabilní alkalické fosfatázy 50 l mořské vody se rozetře na živném agarovém povrchu a analyzovány, jak je popsáno v [11]. Příprava mikrobiální biomasy byla provedena pěstováním produkovat při teplotě 20 ° C v živné půdě, obsahující 1% tryptonu (AGS GmbH, Německo), 0,5% kvasničný extrakt (stejné společnosti) a slanou vodu moře (NaCl - 27,5, MgCI2 - 5, MgS044 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeS04 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. Semenný bujón byl distribuován v 200 ml až 700 ml odměrných baňkách a protřepáván při 150 ot / min po dobu 16 hodin.

Izolace chromozomální DNA byla provedena metodou [13].

Amplifikace 16S genu ribozomální RNA byla provedena polymerázovou řetězovou reakcí, jak je popsáno v [14].

Restrikční reakce amplifikované DNA byla prováděna po dobu 4 hodin při 37 ° C v 20 ul reakční směsi obsahující 2 ekv. jednat. restrikčních enzymů Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI nebo RsaI od NGE SibEnzyme v příslušném pufru. Reakce byla ukončena přidáním 5 ul zastavovacího roztoku obsahujícího 0,1 M EDTA, 0,05% bromfenolové modři a 40% sacharosy.

Elektroforetická separace restrikčních produkty amplifikované DNA byla prováděna v 2% agarózovém (Sigma) v Tris-acetátovém pufru s ethidium bromidem (0,5 mg / l) při 120 V po dobu 4 hodin.

Markery molekulové hmotnosti DNA (100bp +1,5 Kb DNA markery, NGO "SibEnzim") byly použity k určení délky DNA fragmentů. Délka získaného omezení byla stanovena pomocí počítačového programu Gel Pro Analyzer, verze 4.0.00.001. Procentní identita délky fragmentu byla vypočítána pro každou dvojici mikroorganismů srovnáním restrikčních vzorců odděleně pro každý restrikční enzym. Při porovnání délky omezení byly odhadnuty fragmenty DNA identické délky, které se liší nejvýše o 5%.

Pro srovnání experimentálních dat s publikovanými sekvencemi 16S RNA genů byla použita genetická databáze sekvenovaných sekvencí.

VÝSLEDKY A DISKUSE

Čtyři izoláty z kmene přírodní výrobce termolabilní fosfatáza byly izolovány styku s mořskou vodou, označené jako 20, 27, 48 a kmen vyznačující dříve [11] za použití obvyklých technik, jako je Alteromonas Undina. K identifikaci kmenů získaných z biomasy mikroorganismů pěstovaných v kapalném živném prostředí s přídavkem mořských solí byla izolována chromozomální DNA.
Dále, chromozomální DNA byla použita v polymerázové řetězové reakce k amplifikaci RNA gen 16S ribozomální. Amplifikační produkt byl nezávisle ošetřen 6 různými restrikčními endonukleázami. Všechny jsme použili Tetranukleotidové rozpoznávací místo pro restrikční endonukleasu, která umožňuje získat od 3 do 8 fragmentů DNA vyplývající ze štěpení amplifikovaného produktu, o délce asi 1500 bp. Restrikční enzym a používá Sse9I Tru9I jsou v tomto pořadí rozpoznávací místa AATT a TTAA zatímco restrikční enzymy řezaných míst BsuRI a MspI z GGCC a CCGG. Restrikční místa pro rozpoznávání enzym BstMBI a Rsal, respektive GATC a GTAC, obsahuje ve svém složení všech čtyř nukleotidů. Takový výběr restrikční endonukleázy má podle našeho názoru, poskytuje flexibilitu při identifikaci mikroorganismů, které mají obě dodáním bohatý nebo GC-bohaté genomy. Z kvantitativního hlediska je použití pouhých šesti různých omezení věříme optimální, protože použití restrikčních endonukleáz 1 nebo 3, jak je navrženo v několika studiích [10,15] nelze detekovat polymorfismů k identifikaci blízce příbuzných organismů, nebo, alternativně, vedou k příliš velké rozdíly Iz pro jednu nebo více náhodných mutací. Nicméně, použití 10 různých restrikčních endonukleáz nezpůsobí další detekce polymorfizmus délky restrikčních fragmentů DNA je jasně nadbytečný [9].
Obrázek 1 ukazuje, že simulovat pomocí omezení počítač obrazu genov16S RNA, jsme navrhli sadu šesti restrikčními enzymy (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI a RsaI). Geny 16S RNA jsou odebírány v genetické sekvenci sekvencí. Výběr mikroorganismů byl poměrně náhodný. Všechny bakterie patří do různých rodů a představují jak gramnegativní, tak grampozitivní mikroorganismy. Je vidět, že u všech mikroorganismů existuje jedinečný vzor souboru restrikčních enzymů. Počet fragmentů DNA se pohybuje v rozmezí od 23 do 30 (délka fragmentů méně než 100 párů nukleotidů se nepřihlíží). Výsledky výpočtu procenta identity délek fragmentů DNA (restrikční fragment považovány za identické délky se liší o ne více než 5%) pro různé páry mikroorganismů uvedených v tabulce 1. Tato tabulka ukazuje pouze část možných dvojic mikroorganismů, znázorněných na obr. 1. Předložené srovnávací výsledky jsou však zcela typické a umožňují zjistit, že procenta identity délky fragmentu DNA se obvykle pohybují od 12-28% pro zástupce různých mikrobiálních rodů. Tato data tedy ukazují, že restrikce genů 16S RNA navržené kontakt sada restrikčních enzymů může sloužit jako základ pro určení generického si příslušenství bakteriálních buněk.

Obr. 1. Teoreticky vypočtená vzor elektroforetické separaci 16S RNA genu amplifikačních produktů po ošetření s restrikčními enzymy Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) a RsaI (6). Stopy M - značka molekulové hmotnosti

Hodnota 16S RNA v taxonomii. Molekulární hybridizace 16S RNA.

Molekulární hybridizace 16S rRNA. Prokaryotický ribozom sestává z 3 podjednotek, velkých (23S), (5S) a (16S). Gene 16S rRNA má následující vlastnosti, důležité pro fylogenezi:

1. RNA Ribosomy jsou univerzální pro různé druhy, jako samotné ribosomy. 2. Molekula 16S rRNA je konzervativní a nejméně podléhá změnám v průběhu biologické evoluce. Rychlost změny 16S rRNA genu v různých symbiotických bakteriích byla 2-4% nukleotidových substitucí v průběhu 60 m.3. Gene 16S rRNA má oba ultrakonzervativní a variabilní domény (domény), což umožňuje vyhodnotit vzdálené a blízké příbuzné vztahy.4. Navíc Navíc bylo zjištěno, že cystrony rRNA nejsou zapojeny do procesů genetického přenosu mezi jednotlivými druhy.5. Velikost gen (v prokaryotách je dlouhý přibližně 1550-1640 bp) je optimální z hlediska snižování statistických chyb. Plná sekvence může být určena v jedné sekvenci metodou Sanger.Srovnání katalogů nukleotidů. Metoda byla použita na počátku 80. let a měla velký historický význam při systematizaci bakterií. V tomto případě byla molekula RNA (16S rRNA) ošetřena ribonukleázou T, která štěpí molekulu nad zbytky guaninu. Velikost získaných fragmentů nebyla větší než 20 nukleotidů. Výsledné oligonukleotidy byly odděleny 2-merní elektroforézou, sekvenovány a vytvořeny katalog specificky charakterizující rRNA molekulu. Při porovnávání katalogů byly vzaty v úvahu fragmenty o délce alespoň 6 nukleotidů. Aplikací podobnostních koeficientů mezi katalogy byl nejprve vybudován obecný phylogenetický strom pro prokaryoti. Ribopprinting. Metoda je založena na restrikční analýze genů rRNA. Chcete-li to provést, izolujte celkovou DNA z buňky. Dva primery homologní s vysoce konzervovanými hraničními oblastmi genu 16S rRNA (malá podjednotka -s rDNA) genu jsou odebírány a PCR je prováděna. Fragmenty jsou ošetřeny několika restrikčními endonukleázami a restrikční produkty pro každou z endonukleáz jsou odděleny v agarosovém gelu spolu s velikostí profilu DNA. Polymorfismus délky fragmentu vzniká v důsledku skutečnosti, že některé restrikční místa spadají do konzervativních domén genu a některé do variabilních domén. Současně budou některé fragmenty společné pro všechny druhy ve vzorku. Podle počtu běžných a různých fragmentů je možné vypočítat genetickou vzdálenost mezi jednotlivými druhy. Použití 12 restrikčních enzymů s rozpoznávacími místy o délce 4 nukleotidů umožňuje pokrýt 10-15% délky genu 16S rRNA analýzou, aniž by se použilo sekvenování.

Drahý mikrob

Valery Poroiko,
Ph.D., University of Chicago, Oddělení všeobecné chirurgie
Populární mechanika č. 4, 2008

Pouze před sto lety byly mikroby žijící v lidském střevě považovány za freeloadery a škůdce. V posledních letech byla lidská mikrobiota nazývána jako orgán našeho těla, nezbytný pro normální život těla.

Od doby Pasteura je známo, že lidský gastrointestinální trakt je v podstatě bioreaktor toku typu, ve kterém žijí mnohé mikroorganismy. Postoj vědců k intestinální mikroflóře během této doby se radikálně změnil. Před sto lety, velký Ilya Mechnikov, zakladatel moderní teorie imunity, pro vytvoření kterého on přijal Nobelovu cenu (pro dvě osoby s jeho nesmiřitelného soupeře, ne méně než velký Paul Ehrlich), dokonce navrhoval odstranění tlustého střeva jako způsob, jak prodloužit život. A těch, kterým toto opatření jeví jako příliš radikální, doporučuje vypít velké množství jogurtu vytěsnit škodlivý, podle jeho názoru, mikroby prospěšné laktobacily. Za půl století se kurz změnil o 180 stupňů. Ukázalo se, že normální mikroflóra střeva, stejně jako kůže a sliznice, má mnoho užitečných funkcí - například potlačuje životně důležitou aktivitu patogenních mikroorganismů, které útočí na tělo. A v posledních letech, nejodvážnější z mikrobiologů šli ještě dále tím, že prohlásí osobě a jeho symbiotické mikrobů single superorganism.

Vývoj metod molekulární biologie vedl vědce k nové úrovni porozumění procesům symbiózy člověka a jeho mikroflóry, která se zdála být dobře studovaná a od dalšího studia, které neočekávali zvláštní překvapení. Rychlý nárůst rychlosti a snížení nákladů na metody sekvenování DNA (stanovení jeho nukleotidové sekvence) a paralelní růst síly osobního počítače a vývoj internetu umožnily analyzovat informace o velkých částech genomů. Po chromosomu byly sto jednotlivé druhy bakterií transkribována v novém přístupu mikrobiální genetiky - počet obyvatel: analýza genu jednou všechny bakterie obývat konkrétní lokalitu. Samozřejmě, populace "lidského bioreaktoru" se ukázala jako jedna z nejdůležitějších pro studium mikrobiálních populací.

První práce, která provedla úplně nový pohled na intestinální mikroflóru, byla publikována v roce 1999 skupinou vědců z Národního institutu pro zemědělský výzkum (France) a University of Reading (UK). Autoři se rozhodli použít metodu sekvenování genů 16S RNA pro studium populace mikrobiálních střev (viz postranní panel).

16S PHK - identifikace bakterií

První etapou stanovení mikroorganismů je jejich kultivace na živných médiích. Ale řada mikrobů nechce růst na žádném médiu

Moderní techniky
Studijní dříve nedostupné než kultivovatelných bakterie a začnou ukládat pořadí, v naprosto matoucí taxonomie již známé prokaryotické bylo možné s rozvojem bioinformatiky a příchodem moderních technik molekulární biologie - PCR dovoluje oblast DNA, která má přijímat miliardy replik, klonování vybraného genu v bakteriální plazmidy a sekvenování sekvence metodiky nukleotidy získané v dostatečném množství pro analýzu. Ideální marker pro identifikaci mikroorganismů ukázaly genu kódujícího 16S ribozomální RNA (každé ze dvou ribozomální podjednotky - dílny buněčnou proteosyntézu - se skládá z prokládaných řetězců molekul proteinů a ribonukleové kyseliny).

Perfektní značka
Tento gen je v genomu všech známých bakterií a archaea, ale chybí v eukaryotech a viry, a pokud se najít jeho charakteristickou sekvenci nukleotidů, - jsou si jisti, že co do činění s geny z prokaryot. Tento gen má konzervativní místa, stejně pro všechny prokaryoty a druhy specifické. Konzervativní výkresy jsou pro první stupeň polymerázové řetězové reakce - přidání cílové DNA s primery (osiva DNA úseky, na které studoval nukleotidová řetězce by se měly připojit ke spuštění analyzovat zbytek sekvence) a druhově specifických - pro identifikaci druhu. Stupeň podobnosti druhově specifických míst odráží evoluční vztah různých druhů. Pro klonování a následné analýzy mohou být použity velmi ribozomální RNA, která je přítomna v libovolné buňky ve větším množství než odpovídající genu. Nukleotidové sekvence 16S RNA všech známých bakterií a archaea jsou obecně dostupné. Identifikované sekvence se porovnávají s těmi nalezenými v databázích a identifikují druh bakterie nebo prohlašují, že patří k nekultivovaným druhům.

Nová systematika
V poslední době došlo k intenzivní revizi staré fenotypové klasifikace bakterií založené na špatně formalizovaných kritériích - od výskytu kolonií po potravní preference a schopnost skvrnit různými barvivy. Nová systematika je založena na molekulárních kritériích (16S RNA) a jen částečně se opakuje fenotypová.

Co máme uvnitř

Kódující sekvence 16S RNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) byla vymazána přímo z „prostředí“ - 125 mg člověka, bohužel, stolice byl vložen do E. coli plazmidu (ne proto, že střevní, a protože Escherichia coli - jeden z nejoblíbenějších pramenů molekulárních biologů) a opět izolován od kultury násobených bakterií. Tak byla vytvořena knihovna 16S RNA genů pro všechny mikroorganismy ve vzorku. Poté bylo 284 klonů náhodně vybráno a sekvenováno. Ukázalo se, že pouze 24% výsledných 16S RNA sekvencí patřilo k dříve známým mikroorganismům. Tři čtvrtiny mikroflóry se nachází ve střevech každého člověka, více než sto let se vyhnout pozornosti výzkumníků, vyzbrojený metodami klasické mikrobiologie! Vědci prostě nemohl najít podmínky pro pěstování těchto bakterií, protože většina obyvatel náladový střev odmítla vystoupit na tradiční mikrobiální prostředí.

K dnešnímu dni, používající molekulární techniky zjištěno, že dospělý člověk mikroflóry prezentovány 10 z 70 hlavních bakteriálních taxonů. Asi 90% našich mikrobů patří k typu Firmicutes (sem patří například slavný laktobacily - hlavní „viníky“ okyselení mléka) a Bacteroidetes - obligátní anaerobní bakterie (organismy, které mohou žít pouze v nepřítomnosti kyslíku), které jsou často používány jako ukazatel znečištění přírodní vodní kanalizace. Zbývajících 10% populace rozděleno mezi taxonů Proteobacteria (mezi ně patří, mimo jiné, E. coli), Actinobacteria (od jednoho z druhů, aktinomycet antibiotické streptomycinu byl izolován), Fusobacteria (normální obyvatele ústní dutiny a často způsobují periodontitis), verrucomicrobia (v poslední době v geotermální pramen byl objeven ve formě mikrobů, které se živí metanem, které oplývají ve střevě kvůli jiným mikroorganismům), sinice (stále jsou často označovány jako starý - „modro-zelené řasy»), spirochety (naštěstí nd, ne bledý), Synergistes a VadinBE97 (jaký druh zvířat, zeptejte se tvůrci nové taxonomii prokaryotes).

Mikrobiální v nás víc než člověk

Pro tento účel, nejvíce automatizované, počítačové a vysoce výkonné sekvenování DNA technologie, dává možnost analyzovat krátké nukleotidové sekvence, sestavit puzzle několik překrývajících se „písmena“ na koncích těchto stránek několikrát opakovat tento postup pro každý kus genomu a přijímat přepisy jednotlivých genů a chromosomů s rychlosti až 14 miliónů nukleotidů za hodinu - podle řádů rychlejší než my jen před několika lety. Tak bylo zjištěno, že střevní mikroflóra má asi 100000000000000 bakteriální buňky - asi desetkrát větší než je celkový počet lidských buněk v těle.

Sada genů tvořících bakteriální metagenom je přibližně stokrát větší než soubor genů lidského těla. Když hovoříme o objemech biochemických reakcí vyskytujících se v mikrobiální populaci, opět opakovaně překračuje objem biochemických reakcí v lidském těle.

Bakteriální „reaktoru“ nářadí v hostitelské metabolického řetězce, který, který není schopen se sám podporovat - například syntéza vitamínů a jejich prekurzory, rozklad některých toxinů, rozklad celulózy na polysacharidů (u přežvýkavců), atd...

Od dětství až po stáří

Navzdory skutečnosti, že druhové složení střevních mikroorganismů je spíše monotónní, kvantitativní poměr zástupců některých systematických skupin v mikrobiologii různých lidí se může značně lišit. Ale co je normální intestinální mikroflóra a jaké jsou její způsoby vzniku?

Tato otázka byla zodpovězena v práci skupiny amerických biologů pod vedením Patricka Browna ze Stanfordské univerzity v roce 2007. V průběhu prvního roku života vysledovaly vznik 14 mikrobiózních novorozenců. Autoři uspěli ve vytvoření několika zdrojů kolonizace gastrointestinálního traktu. Mikrobiota dětí byla podobná mikroflóře matky: vaginální, fekální nebo mikroflorní vzorky mateřského mléka. V závislosti na zdrojích kolonizace v mikroflóře střev novorozenců během prvního roku života převládaly různé druhy. Tyto rozdíly zůstávaly významné po celou dobu studia, ale ve věku jednoho roku se projevovaly rysy tvorby dospělé mikrobiologie. Zajímavé údaje byly získány za použití dvojice dvojčat. Jejich mikroflóra byla prakticky shodná ve složení a stejným způsobem se lišila. Toto zjištění odhalilo obrovskou roli lidské složky dvojice "microbiota-host" při tvorbě populace střevní mikroflóry. Pro čistotu experimentu by bylo samozřejmě lepší oddělit děti v nemocnici (mimochodem, skvělý příběh indického filmu!) Dvojčata se o sobě dozvídají z analýzy mikroflóry. Data z jiných studií však potvrzují předpoklad, že individuální, včetně hereditárně podmíněných rysů lidské biochemie, mají velký vliv na složení své mikroflóry.

Tenký a hustý

Studie prováděné v laboratoři Jeffrey Gordon (School of Medicine na Washington University, St. Louis, MO), spojí různorodost bakterií trávicího traktu s dietou a vlastností konkrétního metabolismu. Výsledky experimentu byly publikovány v prosincovém čísle časopisu Příroda pro rok 2006. Roční experiment naznačil vznik korelace mezi nadváhou v osobě a složením mikrobiální populace jeho střeva. Tucet tuků, které souhlasily s tím, že si položí břicho na oltář vědy, byly rozděleny do dvou skupin. Jedna vesnice s nízkým obsahem tuku, druhá s nízkým obsahem sacharidů. Všichni dobrovolníci ztratili váhu a současně změnili poměr dvou hlavních skupin střevních mikroorganismů: počet buněk Firmicutes klesl a počet Bacteroidetů se naopak zvýšil. U stravy s nízkým obsahem tuku se tato změna stala později později - po ztrátě 6% hmotnosti a při dietě s nízkým obsahem cukru - po ztrátě prvních kilogramů (2% původní tělesné hmotnosti). Současně byla změna složení mikroflóry ještě výraznější, tím menší byla hmotnost účastníků experimentu.

Boj s obezitou

Výsledky dalšího studia vědců změnit myší symbiotické mikrobiální organismus (viz. Box „testována na myších“) brilantně potvrdila hypotézu, že mikroflóra obézních jedinců zvyšuje hluboké zpracování potravin. Porovnání vzorků DNA stolice obézních a normálních myší ukázalo, že myši obézních myší jsou nasyceny enzymovými geny, které umožňují účinnější rozklad polysacharidů. Střevo obézních myší obsahovaly velký počet konce fermentačních produktů - sloučenin octové a máselné kyseliny, což znamená, důkladnější komponenty pro zpracování potravin. (! Od slova „kalorií“) kalorimetr analýzy vzorků potvrdila, že myší křesla: židle ob / ob-myší obsahovala méně kalorií než u myší divokého typu, které nebyly zcela zaměnitelných energii z potravy.

Kromě důležitých informací o „zárodečné“ složkou autorů obezity byli schopni prokázat zásadní podobnost mezi mikroflóry obézních lidí a myší, což otevírá nové možnosti při studiu problému nadváhy a případně vyřešit tento problém „převodu“ zdravé mikroflóry nebo její tvorby u pacientů kteří trpí obezitou.

Testováno na myších

A s vyčerpáním

Skutečnost, že mikrobiota může řídit metabolismus hostitele, již není pochyb. Výzkum Gordonova laboratoře, věnovaného problému nadměrné hmotnosti, umožnil převedení mostu na léčbu metabolických onemocnění. Mezi nimi jsou takové běžné typy vyčerpání, které postihují děti od jednoho do čtyř let v chudých zemích s tropickým klimatem, jako je marasmus (k marasmu má toto slovo pouze jazykový vztah: řečtina. marasmoz doslovně znamená vyčerpání, vyhynutí) a kwashiorkor (v jazyce jednoho z kmenů Ghany kwashiorkor - "červený chlapec"). Výskyt onemocnění spojených s nedostatkem bílkovin a vitamínů v přechodu od kojení až po dospělé potraviny. Nemoci však selektivně postihují děti, jejichž bratři a sestry nemají problémy s přechodem na tradiční stravu pro tento region. Studie prokázaly, že střevní mikroflóra nemocných dětí je velmi odlišný od mikroflóry svých rodičů, stejně jako mikroflóry zdravých sourozenců. Nejprve byla téměř úplná nepřítomnost ve střevní populaci Bacteroidetes a dominance vzácných druhů patřících k typům Proteobacteria a Fusobacteria. Po nemocné děti (pozor, aby se předávkování!) Vykrmováno hard-protein potraviny, jejich mikroflóry stává podobný normální, jako jsou příbuzní, s převahou Bacteroidetes a Firmicutes.

Nedávné studie nejen radikálně změnila převládající představy o lidské střevní mikroflóry, ale také přispěl ke vzniku konceptu, který považuje střevní mikroflóry jako další multi-buněčné „těla“ člověka. Orgán sestávající z různých buněčných linií, schopných komunikovat s sebou navzájem i s hostitelským organizmem. Orgán, který přerozděluje toky energie, provádí důležité fyziologické reakce, změny pod vlivem životního prostředí a sám se zotavuje se změnami způsobenými vnějšími podmínkami. Pokračoval výzkum „bakteriální tělo“ může a měla by vést k pochopení zákonů jeho fungování, zveřejňování jeho delikátních vztahů s hostitelem a v důsledku toho, že se objevují nové metody boje proti lidské choroby cílenou léčbu dysfunkcí dvou složek metaorganizma.

Analýza 16s RNA

Ribosomální ribonukleové kyseliny (rRNA) - několik molekul RNA, které tvoří základ ribozomu. Hlavní funkcí rRNA je implementace procesu translace - čtení informací z mRNA pomocí adaptace molekul tRNA a katalýza tvorby peptidových vazeb mezi připojenými aminokyselinami tRNA.

Obsah

Ribosomální podtřídy a nomenklatura rRNA

Na elektronomikroskopických snímcích intaktních ribozomů je patrné, že se skládají ze dvou dílčích částic různé velikosti.

Poměr hmotností dílčích těles je

2: 1; hmota, podle pořadí, vyjádřené v konstant měřených přímo sedimentace (rychlost usazování v Svedberg jednotky, S), při ultratsentrifugovanii, a to je tento parametr byl základem pro názvosloví rRNA a ribosomů a ribozomální podjednotky: použitý typ označení

Například ribosomální prokaryotická RNA se sedimentačním koeficientem 16 Svedbergových jednotek je označena jako 16S rRNA.

Vzhledem k tomu, sedimentační koeficienty záviset nejen na molekulové hmotnosti, ale také na tvaru částic, sedimentační koeficienty disociační nonadditive: například, bakteriální ribozom s molekulovou hmotností

3 x 10 Dalton má sedimentační koeficient 70S označený jako 70S a disociuje se na podjednotky 50S a 30S:

Ribosomální částice obsahují jednu molekulu rRNA velké délky, jejíž hmotnost je

1/2 až 2/3 hmoty ribosomální částice, tedy v případě bakteriálních ribozomů 70S obsahuje 50S podkruh 23S rRNA (délka

3000 nukleotidů) a podtřída 30S obsahuje 16S rRNA (délka

1500 nukleotidů); velké ribozomální podjednotky s výjimkou „dlouhé“ rRNA také obsahuje jeden nebo dva „krátké“ rRNA (5S rRNA bakteriální 50S ribozomální podjednotky nebo 5S a 5.8S rRNA bolshii eukaryotické ribozomální podjednotky).

Syntéza

Ribosomální RNA představuje velký podíl (až 80%) celkové buněčné RNA, takové množství rRNA vyžaduje intenzivní transkripci jeho kódovacích genů. Tato intenzita je poskytována velkým počtem kopií genů kódujících rRNA: u eukaryot je několik set (

200 kvasinek) na desítky tisíc (pro různé linie bavlny hlášené 50 - 120 tisíc výtisků) genů uspořádaných do pole tandemových opakování.

U lidí jsou geny kódující rRNA také organizovány do skupin tandemových opakování lokalizovaných v centrálních oblastech chromozomů 13, 14, 15, 21 a 22 krátkého ramene.

Syntetizují se pomocí RNA polymerázy I jako dlouhé molekuly pre-ribosomální RNA, která je rozdělena na jednotlivé RNA, které tvoří základ ribozomů. U bakterií a archea obsahuje počáteční transkript obvykle 16S, 23S a 5S rRNA, mezi kterými jsou umístěny sekvence pre-rRNA odebrané během zpracování. Obvykle jeden nebo více genů tRNA je lokalizováno mezi 16S a 23S rRNA geny; Takže v E. coli má počáteční transkript takové skupiny genů následující sekvenci:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Takový transkript je rozdělen na fragmenty pre-rRNA a tRNA pomocí ribonukleázy III.

V eukaryotech, 18S, 5.8S rRNA a 25/28 společně transkribována RNA polymerázou I, vzhledem k tomu, 5S rRNA gen transkibiruetsya RNA polymerázu III.

V eukaryotech je koncentrace geny prostor kódující rRNA, obvykle zřetelně viditelné v jádře buňky, v důsledku hromadění kolem podjednotek ribozomy, které jsou vlastní montáž bezprostředně probíhá. Tyto akumulace jsou dobře obarveny cytologickými barvivy a jsou známé jako nukleotidy. V souladu s tím, že přítomnost jadérek není specifická pro všechny fáze buněčného cyklu: rozdělení jádra buňky do profáze disociuje protože syntéza a rRNA resuspendovány na konci telofázi vytvořeného při obnovení syntézy rRNA.

Srovnávací analýza pro-a eukaryotické rRNA

Ribosomální RNA (stejně jako ribosomy) prokaryotů a eukaryot se navzájem liší, i když vykazují významnou podobnost oblastí sekvencí. Prokaryotické 70S ribozom se skládá z velkého 50S podjednotku (konstruována na základě dvou molekul rRNA - 5S a 23S) a 30S malé podjednotky (postavené na základě 16S rRNA). 80S eukaryontní ribosomy se skládá z velkého 60S podjednotku (postavené na základě tří molekul rRNA - 5S, 5,8S a 28S) a 40S malé podjednotky (postavené na základě 18S rRNA).

Použití informací o sekvenci

Informace o rRNA konkrétního organismu se používají v medicíně a evoluční biologii.

  • Gen rRNA je jedním z nejkonzervativnějších (nejméně variabilních) genů. Proto je možné na základě analýzy podobností a rozdílů v sekvencích rRNA stanovit systematické umístění organismu a čas divergence s příbuznými druhy.
  • rRNA je cílem velkého množství antibiotik, z nichž některé se používají v klinické praxi, a to jak pro inhibici růstu bakterií (antibiotika, prokaryotické ribozomu vázání) a pro léčbu lidského onemocnění (antibiotika váží na eukaryotické ribozom). První skupina zahrnuje chloramfenikol, erythromycin, kasugamycin, mikrocoxin, spectinomycin, streptomycin, thiostrepton. K druhému hygromycinu B paromomycin.

Předchozí Článek

Dieta pro hepatitidu A

Následující Článek

Léky na hepatitidu B

Související Články Hepatitida